TP proposé par G.Grousset, réalisé au lycée La Martinière Duchère,
à partir d’un TP proposé aux journées nationales ExAO et nouvelles technologies de Marseille

Matériel nécessaire

 un cœur de mouton, de porc ou de bœuf,
 une planche, un couteau à découper,
 un broyeur ou mini-moulinette,
 une balance électronique,
 une centrifugeuse, tubes à centrifuger,
 un ou deux cristallisoirs,
 tubes à hémolyse dans portoir,
 un bécher, un erlenmeyer, un agitateur (baguette de verre),
 deux pipettes de 10 mL avec poire,
 réserve de glace,
 400 mL d’une solution tampon, pH=7,2,
 un milieu d’extraction des mitochondries (cf préparation ci-dessous),
 une solution de succinate de sodium à pH=7,2,
 une solution de glucose à 20 g/L (diluée dans la solution tampon)
 feuilles de Laurier cerise, mortier, pilon,
 système d’ExAO avec mesure d’oxymétrie, prêt à l’emploi,
 3 seringues ExAO avec aiguille coudée et cathéter.

Préparation des solutions

• milieu d’extraction
  
   solution de phosphate monopotassique à 9,08 g de KH₂PO₄ par litre,
   solution de phosphate disodique à 9,47 g de Na₂HPO₄ par litre,
   mélanger 322 mL de la solution de phosphate disodique et 78 mL de la solution de phosphate monopotassique pour obtenir 400 mL de solution tampon à pH= 7,2,
   ajouter aux 400 mL, 800 mg de Sérum Albumine bovine (S.A.B.),
   ajouter enfin 45 g de mannitol et éventuellement 0,02 g de KCl et 0,02 g de MgCl₂.
   
• solution de succinate de sodium (acide organique du cycle respiratoire)
  
   faire 10 mL à une concentration de 400 mmoles (acide succinique C₄H₆O₄, PM=118 g),
   amener ensuite, au pHmètre, avec de la soude à 30%, l’acide succinique à pH=7,2. NB : une utilisation directe d’acide succinique ne permettra pas de réaliser la manipulation,
   si l’on dispose de succinate de sodium, faire simplement une solution de succinate à 20 g/L (contrôler le pH et l’amener éventuellement à 7,2).
   
• solution d’acide cyanhydrique (inhibiteur de respiration)
  
   découper 2 ou 3 feuilles de Laurier Cerise dans un mortier et broyer en ajoutant 20 mL environ de solution tampon.
   la solution doit avoir une légère odeur d’amande amère.

Protocole d’extraction : suivre les schémas ci-dessous

 si l’on ne dispose pas de centrifugeuse, on peut filtrer au lieu de centrifuger (opération 9)
 filtrer alors sur coton et recueillir le filtrat.
 



 oxygéner le surnageant obtenu (ou le filtrat) dans un bécher sur glace à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 5 min au moins avant l’utilisation afin de saturer en O₂ les transporteurs et favoriser l’épuisement en substrats divers.

Eléments pour l’élaboration d’un protocole de mesure

 prévoir une mesure d’environ 8 min,
 utiliser 6 mL de suspension mitochondriale dans l’enceinte de mesure,
 la quantité de substances à introduire à la seringue est de 0,1 mL /injection.
 On rappelle que :
• le glucose est un métabolite respiratoire cellulaire,
• l’acide succinique est un métabolite respiratoire,
• l’acide cyanhydrique est un poison de la respiration, c’est-à-dire qu’il bloque l’activité respiratoire.

Pistes d’utilisation

 distinction respirations cellulaire et mitochondriale,
 nécessité de dégradation du glucose dans la cellule,
 utilisation finale du dioxygène dans les mécanismes respiratoires.

Voir des exemples d’enregistrements ExAO :
-> Action glucose, succinate ;
-> Blocage par l’antimycine, par des extraits de laurier-cerise.