TP proposé par G.Grousset, réalisé au lycée La Martinière Duchère,
à partir d’un TP proposé aux journées nationales ExAO et nouvelles technologies de Marseille

Matériel nécessaire

• un cœur de mouton, de porc ou de bœuf,
• une planche, un couteau à découper,
• un broyeur ou mini-moulinette,
• une balance électronique,
• une centrifugeuse, tubes à centrifuger,
• un ou deux cristallisoirs,
• tubes à hémolyse dans portoir,
• un bécher, un erlenmeyer, un agitateur (baguette de verre),
• deux pipettes de 10 mL avec poire,
• réserve de glace,
• 400 mL d’une solution tampon, pH=7,2,
• un milieu d’extraction des mitochondries (cf préparation ci-dessous),
• une solution de succinate de sodium à pH=7,2,
  – une solution de glucose à 20 g/L (diluée dans la solution tampon)
• feuilles de Laurier cerise, mortier, pilon,
• système d’ExAO avec mesure d’oxymétrie, prêt à l’emploi,
• 3 seringues ExAO avec aiguille coudée et cathéter.

Préparation des solutions

Milieu d’extraction

• solution de phosphate monopotassique à 9,08 g de KH₂PO₄ par litre,
• solution de phosphate disodique à 9,47 g de Na₂HPO₄ par litre,
• mélanger 322 mL de la solution de phosphate disodique et 78 mL de la solution de phosphate monopotassique pour obtenir 400 mL de solution tampon à pH= 7,2,
• ajouter aux 400 mL, 800 mg de Sérum Albumine bovine (S.A.B.),
• ajouter enfin 45 g de mannitol et éventuellement 0,02 g de KCl et 0,02 g de MgCl₂.
   

Solution de succinate de sodium (acide organique du cycle respiratoire)

• faire 10 mL à une concentration de 400 mmoles (acide succinique C₄H₆O₄, PM=118 g),
• amener ensuite, au pHmètre, avec de la soude à 30%, l’acide succinique à pH=7,2. NB : une utilisation directe d’acide succinique ne permettra pas de réaliser la manipulation,
• si l’on dispose de succinate de sodium, faire simplement une solution de succinate à 20 g/L (contrôler le pH et l’amener éventuellement à 7,2).

Solution d’acide cyanhydrique (inhibiteur de respiration)

• découper 2 ou 3 feuilles de Laurier Cerise dans un mortier et broyer en ajoutant 20 mL environ de solution tampon.
• la solution doit avoir une légère odeur d’amande amère.

Protocole d’extraction : suivre les schémas ci-dessous

• si l’on ne dispose pas de centrifugeuse, on peut filtrer au lieu de centrifuger (opération 9)
• filtrer alors sur coton et recueillir le filtrat.
   

  

• oxygéner le surnageant obtenu (ou le filtrat) dans un bécher sur glace à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 5 min au moins avant l’utilisation afin de saturer en O₂ les transporteurs et favoriser l’épuisement en substrats divers.

Éléments pour l’élaboration d’un protocole de mesure

• prévoir une mesure d’environ 8 min,
• utiliser 6 mL de suspension mitochondriale dans l’enceinte de mesure,
• la quantité de substances à introduire à la seringue est de 0,1 mL /injection.
• On rappelle que :
  • le glucose est un métabolite respiratoire cellulaire,
  • l’acide succinique est un métabolite respiratoire,
  • l’acide cyanhydrique est un poison de la respiration, c’est-à-dire qu’il bloque l’activité respiratoire.

Pistes d’utilisation

• distinction respirations cellulaire et mitochondriale,
• nécessité de dégradation du glucose dans la cellule,
• utilisation finale du dioxygène dans les mécanismes respiratoires.

Voir des exemples d’enregistrements ExAO :
-> Action glucose, succinate ;
-> Blocage par l’antimycine, par des extraits de laurier-cerise.