Recherche expérimentale et manipulation mise au point par Mme Suzanne Garaix, professeur agrégée au Lycée International Lyon Cedex 07.

Matériel

 une boîte de levures Saccharomyces cerevisiae ade 1 ou ade 2 sur milieu solide pour ensemencement (ENS Lyon),
 un tube à UV à filtre 4w, 254 nm, et une enceinte isolante, adaptée à la dimension de la lampe UV sur socle (fabrication à prévoir). L’intérieur devra être peint en noir
 2 paires de lunettes anti UV 100%
 2 écrans faciaux
 2 visières
 produits pour milieu complet à stériliser :

• solide (20 g d’extrait de malt, 2 g d’extrait de levures, 20 g de glucose, 1 litre d’eau distillée, 15 g d’agar)
• liquide (20 g d’extrait de malt, 2 g d’extrait de levures, 20 g de glucose, 1 litre d’eau distillée)

 tubes stériles
 20 boîtes de Pétri, eau distillée stérile
 ensemenceur
 agitateur électrique vortex, une étuve, un chronomètre
 un feutre marqueur ou des étiquettes collantes pour marquer les boîtes
 Fascicule : "Travaux pratiques de biologie des levures " Didier POL, collection Ellipses

Précautions

 Travailler dans des conditions d’asepsie, près d’un bec Bunsen allumé avant et durant la manipulation.
 Le protocole suivant doit être commencé 4 à 6 jours avant l’observation des résultats.
 Les mutations éventuelles sont provoquées sur les levures isolées, avant le développement des colonies.

Technique opératoire

 prélever avec la pointe d’un cure-dent stérile, sur milieu solide, des levures ade1 ou ade2. Le prélèvement doit avoir la grosseur d’une tête d’épingle.
 déposer ce prélèvement dans un tube contenant 3 ml de milieu liquide complet.
 agiter avec le vortex
 faire pousser une nuit à 30°C
 le lendemain matin, agiter le tube puis diluer entre 1/3000 et 1/5000 dans de l’eau distillée stérile
 prélever 200 µl de ce milieu dilué, étaler sur une boîte de Pétri contenant le milieu complet solide stérile
 préparer ainsi une vingtaine de boîtes de Pétri identiques
 conserver deux boîtes qui ne seront pas exposées aux UV, comme témoins
 exposer à la lampe à UV toutes les autres boîtes aussitôt après préparation :

• allumer le tube à UV 1 heure avant son utilisation et le laisser allumé pendant toute la durée de la manipulation afin que l’énergie débitée soit constante. Placer sur le tube une enceinte isolante qui ne sera soulevée qu’au moment du passage de la boîte
• se munir de gants, de lunettes anti-UV, d’un écran facial avec visière
• prévoir une durée d’exposition différente pour chaque boîte, par exemple : 2 s, 4s, 6s, 10s, 20s, 30s, 40s, 60s, 2 min, 3 min, ... Ne pas oublier de marquer la durée d’exposition sur chaque boîte
• soulever l’enceinte isolante au moment de passer la boîte sous le tube
• placer la boîte, sans couvercle, sur le socle, sous le faisceau d’UV le temps désiré. Pour exposer chaque culture de la même façon, faire un repère sur le socle.
• replacer l’enceinte isolante immédiatement après.

 mettre toutes les boîtes, exposées ou non aux UV, à l’étuve à 30°C
 les résultats sont obtenus au bout de 3 à 5 jours.

Résultats obtenus et pistes d’utilisation

Programme de seconde, biologie, partie II : les mutations introduisent une variabilité de l’information génétique. Certains agents de l’environnement peuvent augmenter le taux de mutations.

Boîte S.cerevisiae ade2, exposée 10s		Boîte S.cerevisiae ade2, exposée 10s (détail)
Boîte S.cerevisiae ade2, exposée 30s		Boîte S.cerevisiae ade2, exposée 30s (détail)
Boîte S.cerevisiae exposée 90s		Boîte S.cerevisiae exposée 90s (détail)
Boîte S.cerevisiae exposée 150s		Boîte S.cerevisiae exposée 150s (détail)

Exploitation des résultats

Les levures utilisées (souches ade1 et ade2) sont auxotrophes pour l’adénine. Elles ne peuvent donc pas se développer sur un milieu "minimum".

Sur un milieu complet, elles commencent la chaîne de réactions qui conduirait à la synthèse de l’adénine, mais il y a blocage par le fait de la mutation du gène ade1 ou ade2 au niveau d’une molécule qui s’accumule (phosphoribosyl aminoimidazole), et qui, au contact de l’air, devient rouge. Les levures cultivées dans le cas présent constitueront donc des colonies rouges.

Document issu de "Biologie des levures" de Didier Pol :

version modifiable

NB : sur un milieu particulier, très riche en adénine, les levures ade1 et ade2 font l’économie de toute la chaîne de réactions qui conduit à la synthèse de l’adénine, les colonies sont alors de couleur habituelle, c’est à dire crème. L’expérimentation conduite ici se fait sur milieu complet standard : elles seront donc de couleur rouge.

Les UV provoquent des mutations chez ces levures, ainsi, les levures cultivées - rouges - subissent une nouvelle mutation.

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Fichier de séquences : ade2.edi