Matériel nécessaire

• œufs de caille en incubation depuis 3 jours à 37 degrés
• loupe binoculaire, étuve réglée à 37 degrés
• javel, coton, alcool, feutre marqueur indélébile
• poubelle en verre, centrifugeuse électrique
• instruments et milieux stériles :
  • 5 ou 6 feuilles de papier pliées en deux dans champ stérile (dans papier alu)
  • ciseaux fins, pinces à bout rond, aiguilles affutées (=microscalpels)
  • récipient en verre,petit récipient en verre, 2 pipettes Pasteur boutonnées et cotonnées et poire
  • une boite de Pétri remplie de paraffine noire (paraffine additionnée de noir animal)
  • épingles très fines (à insectes n. 0)
  • tubes à centrifuger
  • un flacon de culture cellulaire (flacon plat)
  • un flacon de milieu (milieu de Tyrode)
  • milieu de culture enrichi en sérum de veau (10 pour cent), tube à hémolyse
  • Trypsine EDTA + antibiotiques (1 ml en tube à hémolyse).

Protocole de mise en culture de cellules d’embryon de caille

• nettoyer la paillasse à la javel en enlevant tout objet personnel puis se laver soigneusement les mains et avant-bras.
• les instruments stériles ne sont jamais posées sur la paillasse mais glissés entre les feuilles de papier stériles, le papier alu étant replié par dessus
• passer l’oeuf à l’alcool à l’aide du coton ; découper une fenêtre au sommet de la coquille (petit bout) avec les ciseaux.
• verser le contenu de l’oeuf dans le récipient stérile contenant le milieu de Tyrode.
• repérer l’embryon et découper l’aire extra-embryonnaire à l’aide des ciseaux
• transférer l’embryon dans le petit récipient stérile rempli de milieu de Tyrode à l’aide de la pince ; éliminer le jaune résiduel en agitant
• transférer l’embryon dans la boite de Pétri à fond noir remplie de milieu de Tyrode
• épingler l’aire extra-embryonnaire en inclinant les épingles pour ne pas gêner l’observation
• observer l’embryon à la loupe binoculaire
• dégager l’embryon de ses enveloppes à l’aide des microscalpels
• prélever doucement l’embryon à l’aide d’une pipette Pasteur et l’installer dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA (digestion ménagée des protéines embryonnaires) additionnée
  de 1% d’antibiotiques.
• placer le tube contenant l’embryon à l’étuve à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes selon sa taille.
• à l’aide d’une pipette Pasteur aspirer et rejeter plusieurs fois l’embryon qui se désagrège alors
• ajouter immédiatement 1 ml de milieu de culture contenant du sérum à 10% inhibant l’action de la trypsine ; bien mélanger par aspirations et rejets successifs puis ajouter à nouveau 2 ml de milieu enrichi en sérum afin d’inhiber complètement les protéases. Bien mélanger.
• centrifuger le tube 10 secondes à 1200 tours minute, jeter le surnageant ; ajouter 1 ml de milieu de culture pour faire une suspension cellulaire
• introduire stérilement dans le flacon de culture cellulaire 1 ml ou un peu plus de suspension cellulaire
• placer ce flacon bien horizontalement dans l’étuve à 37 degrés

Suivi des cultures

• le lendemain, ajouter du milieu afin d’avoir une épaisseur de liquide d’environ 1 mm.
• tous les 2 ou 3 jours, éliminer stérilement le tiers ou plus de milieu de culture et le remplacer par du milieu neuf.

  

Résultats et conditions d’obtention de résultats

• nécessité de posséder un microscope inversé à contraste de phase pour l’observation des cellules vivantes
• on obtient le lendemain des fibroblastes et un peu plus tard des neurones qui s’organisent en réseau
• TP coûteux (notamment flacons de cultures et microscope !) et nécessitant le respect de la stérilité, sinon on cultive des bactéries !
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