• Matériel nécessaire

• oeufs de caille en incubation depuis 3 jours à 37 degrés
• loupe binoculaire, étuve réglée à 37
  degrés
• javel, coton, alcool, feutre marqueur indélébile
• poubelle en verre, centrifugeuse électrique
• instruments et milieux stériles :
  • 5 ou 6 feuilles de
    papier pliées en deux dans champ stérile (dans papier alu)
  • ciseaux fins, pinces à bout rond, aiguilles affutées
    (=microscalpels)
  • récipient en verre,petit récipient en
    verre, 2 pipettes Pasteur boutonnées et cotonnées et poire
  • une boite de Pétri remplie de paraffine noire (paraffine
    additionnée de noir animal)
  • épingles très fines (à insectes n. 0)
  • tubes à centrifuger
  • un flacon de culture cellulaire (flacon plat)
  • un flacon de milieu (milieu de Tyrode)
  • milieu de culture enrichi en sérum de veau (10 pour cent), tube à hémolyse
  • Trypsine EDTA + antibiotiques (1 ml en tube à
    hémolyse).

• Protocole de mise en culture de cellules d’embryon de caille

nettoyer la paillasse à la javel en enlevant tout objet
personnel puis se laver soigneusement les mains et avant-bras.

les instruments stériles ne sont jamais posées sur la paillasse mais glissés entre les feuilles de papier stériles, le papier alu étant replié par dessus

passer l’oeuf à l’alcool à l’aide du coton ; découper une fenêtre au sommet de la coquille (petit bout) avec les ciseaux.

verser le contenu de l’oeuf dans le récipient stérile contenant le milieu de Tyrode.

repérer l’embryon et découper l’aire
extra-embryonnaire à l’aide des ciseaux

transférer l’embryon dans le petit récipient stérile rempli de milieu de Tyrode à l’aide de la pince ; éliminer le jaune résiduel en agitant

transférer l’embryon dans la boite de Pétri à fond noir remplie de milieu de Tyrode

épingler l’aire extra-embryonnaire en inclinant les épingles pour ne pas gêner l’observation

observer l’embryon à la loupe binoculaire

dégager l’embryon de ses enveloppes à l’aide des microscalpels

prélever doucement l’embryon à l’aide d’une pipette Pasteur et l’installer dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA (digestion ménagée des protéines embryonnaires) additionnée
de 1% d’antibiotiques.

placer le tube contenant l’embryon à l’étuve à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes selon sa
taille.

à l’aide d’une pipette Pasteur aspirer et rejeter plusieurs fois
l’embryon qui se désagrège alors

ajouter immédiatement 1 ml de milieu de culture contenant du
sérum à 10% inhibant l’action de la trypsine ; bien mélanger par aspirations et rejets successifs puis ajouter à nouveau 2 ml de milieu enrichi en sérum afin d’inhiber complètement les protéases. Bien mélanger.

centrifuger le tube 10 secondes à 1200 tours
minute, jeter le surnageant ; ajouter 1 ml de milieu de culture pour faire une suspension cellulaire

introduire stérilement dans le flacon de culture
cellulaire 1 ml ou un peu plus de suspension cellulaire

placer ce flacon bien horizontalement dans l’étuve à 37 degrés

• Suivi des cultures

le lendemain, ajouter du milieu afin d’avoir une épaisseur de liquide d’environ 1 mm.

tous les 2 ou 3 jours, éliminer stérilement le tiers ou plus de milieu de culture et le remplacer par du milieu neuf.

• nécessité de posséder un microscope
  inversé à contraste de phase pour l’observation des cellules vivantes
• on obtient le lendemain des fibroblastes et un peu plus tard des
  neurones qui s’organisent en réseau