Cultures de cellules embryonnaires
Courrier à l’auteur
TP proposé par Mme M.J. Pellerin, lycée La Martinière Duchère, Lyon (69)
TP proposé par Mme M.J. Pellerin, lycée La Martinière Duchère, Lyon (69)
- Matériel nécessaire
- oeufs de caille en incubation depuis 3 jours à 37 degrés
- loupe binoculaire, étuve réglée à 37
degrés - javel, coton, alcool, feutre marqueur indélébile
- poubelle en verre, centrifugeuse électrique
- instruments et milieux stériles :
- 5 ou 6 feuilles de
papier pliées en deux dans champ stérile (dans papier alu) - ciseaux fins, pinces à bout rond, aiguilles affutées
(=microscalpels) - récipient en verre,petit récipient en
verre, 2 pipettes Pasteur boutonnées et cotonnées et poire - une boite de Pétri remplie de paraffine noire (paraffine
additionnée de noir animal) - épingles très fines (à insectes n. 0)
- tubes à centrifuger
- un flacon de culture cellulaire (flacon plat)
- un flacon de milieu (milieu de Tyrode)
- milieu de culture enrichi en sérum de veau (10 pour cent), tube à hémolyse
- Trypsine EDTA + antibiotiques (1 ml en tube à
hémolyse).
- 5 ou 6 feuilles de
- Protocole de mise en culture de cellules d’embryon de caille
- nettoyer la paillasse à la javel en enlevant tout objet
personnel puis se laver soigneusement les mains et avant-bras. - les instruments stériles ne sont jamais posées sur la paillasse mais glissés entre les feuilles de papier stériles, le papier alu étant replié par dessus
- passer l’oeuf à l’alcool à l’aide du coton ; découper une fenêtre au sommet de la coquille (petit bout) avec les ciseaux.
- verser le contenu de l’oeuf dans le récipient stérile contenant le milieu de Tyrode.
- repérer l’embryon et découper l’aire
extra-embryonnaire à l’aide des ciseaux - transférer l’embryon dans le petit récipient stérile rempli de milieu de Tyrode à l’aide de la pince ; éliminer le jaune résiduel en agitant
- transférer l’embryon dans la boite de Pétri à fond noir remplie de milieu de Tyrode
- épingler l’aire extra-embryonnaire en inclinant les épingles pour ne pas gêner l’observation
- observer l’embryon à la loupe binoculaire
- dégager l’embryon de ses enveloppes à l’aide des microscalpels
- prélever doucement l’embryon à l’aide d’une pipette Pasteur et l’installer dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA (digestion ménagée des protéines embryonnaires) additionnée
de 1% d’antibiotiques. - placer le tube contenant l’embryon à l’étuve à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes selon sa
taille. - à l’aide d’une pipette Pasteur aspirer et rejeter plusieurs fois
l’embryon qui se désagrège alors - ajouter immédiatement 1 ml de milieu de culture contenant du
sérum à 10% inhibant l’action de la trypsine ; bien mélanger par aspirations et rejets successifs puis ajouter à nouveau 2 ml de milieu enrichi en sérum afin d’inhiber complètement les protéases. Bien mélanger. - centrifuger le tube 10 secondes à 1200 tours
minute, jeter le surnageant ; ajouter 1 ml de milieu de culture pour faire une suspension cellulaire - introduire stérilement dans le flacon de culture
cellulaire 1 ml ou un peu plus de suspension cellulaire - placer ce flacon bien horizontalement dans l’étuve à 37 degrés
- Suivi des cultures
- le lendemain, ajouter du milieu afin d’avoir une épaisseur de liquide d’environ 1 mm.
- tous les 2 ou 3 jours, éliminer stérilement le tiers ou plus de milieu de culture et le remplacer par du milieu neuf.

- nécessité de posséder un microscope
inversé à contraste de phase pour l’observation des cellules vivantes- on obtient le lendemain des fibroblastes et un peu plus tard des
neurones qui s’organisent en réseau
nécessitant le respect de la stérilité, sinon on cultive des bactéries !
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