• Matériel

  
   cuve à chromatographie (conserves cylindriques de 2 litres Pierron par exemple),
   un rouleau de scelofrais pour fermer les cuves,
   papier Whatman n°1 dans lequel on découpe des rectangles de 16 cm x 14 cm,
   pinces fines pour manipuler les feuilles à chromatographie,
   une agrafeuse pour former des cylindres avec les rectangles,
   des micropipettes pour déposer les gouttes de solution
   séchoir(s) à cheveux,
   vaporisateur opaque pour contenir le révélateur,
   une planchette de bois ou des punaises.

  
   
  

• Préparation préalable des
  solutions

  
   le solvant : mélange de solvants organiques, à préparer 24 h à l’avance sous la hotte ; mettre dans l’ordre :

  • 50 mL d’alcool butylique,
  • 20 mL d’acide acétique glacial,
  • 30 mL d’eau distillée

  
   les solutions d’acides aminés : leucine, glycine,...
  au choix :

  • 6 mg d’acide aminé dans 1 mL d’eau distillée

  
   la solution de caséine :

  • une pincée de caséine dans 100 mL d’eau distillée

  
   l’hydrolysat de caséine préparé 24 h
  à l’avance à 37° :

  • une pincée de caséine + une pincée de
    pancréatine dans 100 mL d’eau distillée (vérifier
    le pH, l’ajuster à la soude à pH=7,5 à 8)

  
   la solution de ninhydrine à préparer obligatoirement
  sous la hotte :

  • dissoudre 0,2 mg de ninhydrine dans 100 mL d’acétone.
    La mettre en flacon opaque ou mieux dans un vaporisateur opaque.

  
   
  

• Mode opératoire

Remarque : la cuve à chromatographie est préparée
24 h à l’avance avec 1cm de solvant au fond. Elle est fermée
hermétiquement avec le scélofrais.

1- Préparer la feuille à chromatographie :

 découper un rectangle de 16 x 14 cm,
 tracer un léger trait de crayon à 1,5 cm du bord inférieur du rectangle : sur ce trait seront déposées les microgouttes,
 en prévoir 4 pour les 14 cm. Un espace d’au moins 2,5 cm doit être respecté entre les gouttes. La première et la dernière doivent être déposées au moins à 2 cm du bord vertical,
 si l’on dispose de plus de 2 solutions d’acides aminés, il faut prévoir un autre chromatogramme (2ème groupe de TP)


 

2 - Déposer les microgouttes :

 bien noter l’ordre des dépôts, par exemple :


 

solution de caséine - hydrolysat de caséine - solution
de leucine - solution de glycine

 déposer une microgoutte un peu au dessus du trait ; sécher au sèche-cheveux puis en déposer une autre par dessus, sécher,... On peut aller jusqu’à 4 ou 5 gouttes superposées.
 procéder ainsi pour chaque solution.


 

3 - Faire un cylindre avec la feuille à chromatographie.
Mettre une agrafe à la partie supérieure (ou un
trombone) ; lorsque les 2 bords du rectangle sont proches (éviter
un trop grand chevauchement)...une deuxième agrafe au bord
inférieur n’est pas nécessaire : on a alors un cône.

4 - Placer ensuite le cylindre
(le cône) dans la cuve en l’appuyant contre un bord.

En aucun cas, le solvant ne doit atteindre les microgouttes
séchées ; il doit le faire par capillarité.

Refermer immédiatement la cuve.

5 - Au bout d’une heure, sortir le cylindre.
Découper le papier autour de l’agrafe pour le dérouler.
Sécher complètement à l’aide du séchoir
à cheveux le chromatogramme en évitant de le déchirer.
Le fixer sur un support en bois avec les punaises.

6 - Révéler (à ne pas
faire faire aux élèves) : vaporiser sous la hotte
la solution de ninhydrine sur le(s) chromatogramme(s).

7 - Sécher à l’air sous la hotte,
puis attendre une demi-heure avant d’interpréter le chromatogramme.

Remarque : une autre méthode consiste à passer,
sous hotte, le révélateur au pinceu brosse : passer
la couche légèrement sans surépaisseur.

NB : Acides aminés indispensables chez l’homme :

• Liens

  
   Fiche technique de la chromatographie des glucides
   Fiche technique de la chromatographie de l’acide lactique
   Fiche technique de la chromatographie des acides du vin