• Matériel
  • cuve à chromatographie (conserves cylindriques de 2 litres Pierron par exemple),
  • un rouleau de scelofrais pour fermer les cuves,
  • papier Whatman n°1 dans lequel on découpe des rectangles de 16 cm x 14 cm,
  • pinces fines pour manipuler les feuilles à chromatographie,
  • une agrafeuse pour former des cylindres avec les rectangles,
  • des micropipettes pour déposer les gouttes de solution
  • séchoir(s) à cheveux,
  • vaporisateur opaque pour contenir le révélateur,
  • une planchette de bois ou des punaises.
• Préparation préalable des solutions
  • le solvant : mélange de solvants organiques, à préparer 24 h à l’avance sous la hotte ; mettre dans l’ordre :
    • 50 mL d’alcool butylique,
    • 20 mL d’acide acétique glacial,
    • 30 mL d’eau distillée
  • les solutions d’acides aminés : leucine, glycine,... au choix :
    • 6 mg d’acide aminé dans 1 mL d’eau distillée
  • la solution de caséine :
    • une pincée de caséine dans 100 mL d’eau distillée
  • l’hydrolysat de caséine préparé 24 h à l’avance à 37° :
    • une pincée de caséine + une pincée de pancréatine dans 100 mL d’eau distillée (vérifier le pH, l’ajuster à la soude à pH=7,5 à 8)
  • la solution de ninhydrine à préparer obligatoirement sous la hotte :
    • dissoudre 0,2 mg de ninhydrine dans 100 mL d’acétone. La mettre en flacon opaque ou mieux dans un vaporisateur opaque.

    
     
    

• Mode opératoire

Remarque : la cuve à chromatographie est préparée 24 h à l’avance avec 1cm de solvant au fond. Elle est fermée hermétiquement avec le scélofrais.

1- Préparer la feuille à chromatographie :

• découper un rectangle de 16 x 14 cm,
• tracer un léger trait de crayon à 1,5 cm du bord inférieur du rectangle : sur ce trait seront déposées les microgouttes,
• en prévoir 4 pour les 14 cm. Un espace d’au moins 2,5 cm doit être respecté entre les gouttes. La première et la dernière doivent être déposées au moins à 2 cm du bord vertical,
• si l’on dispose de plus de 2 solutions d’acides aminés, il faut prévoir un autre chromatogramme (2ème groupe de TP)

2 - Déposer les microgouttes :

• bien noter l’ordre des dépôts, par exemple : solution de caséine - hydrolysat de caséine - solution de leucine - solution de glycine
• déposer une microgoutte un peu au dessus du trait ; sécher au sèche-cheveux puis en déposer une autre par dessus, sécher,... On peut aller jusqu’à 4 ou 5 gouttes superposées.
• procéder ainsi pour chaque solution.

3 - Faire un cylindre avec la feuille à chromatographie. Mettre une agrafe à la partie supérieure (ou un trombone) ; lorsque les 2 bords du rectangle sont proches (éviter
un trop grand chevauchement)...une deuxième agrafe au bord inférieur n’est pas nécessaire : on a alors un cône.

4 - Placer ensuite le cylindre (le cône) dans la cuve en l’appuyant contre un bord.

En aucun cas, le solvant ne doit atteindre les microgouttes séchées ; il doit le faire par capillarité.

Refermer immédiatement la cuve.

5 - Au bout d’une heure, sortir le cylindre. Découper le papier autour de l’agrafe pour le dérouler. Sécher complètement à l’aide du séchoir à cheveux le chromatogramme en évitant de le déchirer. Le fixer sur un support en bois avec les punaises.

6 - Révéler (à ne pas faire faire aux élèves) : vaporiser sous la hotte la solution de ninhydrine sur le(s) chromatogramme(s).

7 - Sécher à l’air sous la hotte, puis attendre une demi-heure avant d’interpréter le chromatogramme.

Remarque : une autre méthode consiste à passer, sous hotte, le révélateur au pinceu brosse : passer la couche légèrement sans surépaisseur.

NB : Acides aminés indispensables chez l’homme :