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Méthode de l’immunodiffusion ou test d’Ouchterlony

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Principe de l’immunodiffusion

Les protéines en général et les immunoglobulines ou les substances antigéniques en particulier, possèdent la propriété de diffuser dans la gélose. Il suffit donc de percer des puits disposés de façon équidistante dans la gélose contenue dans une boîte de Pétri, d’y déposer les substances à tester pour que 24 à 48 h plus tard, les substances se soient rencontrées.
S’il s’avère qu’un sérum contient des anticorps (immunoglobulines) spécifiques d’une des substances antigéniques présentes, il y aura alors formation, à égale distance des deux puits concernés, d’un précipité en forme d’arc correspondant au complexe immun.
Ce test peut donc permettre de vérifier la spécificité d’un anticorps.

Matériel nécessaire (exemple : précipitation de l’antigène BSA)

  • sérum de lapin normal (N)
  • sérum de lapin (P) ayant reçu plusieurs injections à intervalles de temps répétés, sur plusieurs semaines, de l’albumine de sérum de boeuf (Sérum Albumine Bovine ou BSA)
  • Albumine de sérum de boeuf en solution (BSA)
  • Albumine de blanc d’oeuf en solution (O)
  • Caséine (C)
  • Autre protéine (P)
  • Emporte-pièce ou perce-bouchon de 4 mm de diamètre
  • 2 Boites de Pétri de 5 ou 6 cm de diamètre, gélosée avec 6 puits dont un central
  • Papier noir, lampe
  • Étuve, réglée à 25 degrés

Préparation des boîtes

  • couler la gélose dans les boîtes de Pétri
  • après refroidissement, percer à l’emporte-pièces des trous régulièrement espacés.

Boîte prête à l’emploi

Dépôts des substances

    • dans le puits central déposer le sérum P dans la première boîte et N dans la seconde.

    Dépôt à la pipette
    • dans les puits périphériques, déposer les différentes protéines (BSA, O, C, X)
      - lors de ces dépôts, on veillera à ne faire ni débordement ni éclaboussures et à remplir suffisamment chaque puits. Il est conseillé de s’exercer avant à l’utilisation de la pipette Pasteur.

Marquage de la boîte

    • il faut marquer sur le couvercle le nom des dépôts et faire un trait de feutre entre boîte et couvercle au cas où celui-ci tournerait.
    • la boite est placé à l’étuve pendant 24 heures au minimum.
      NB : la vitesse de migration des substances dans la gélose dépend de la température, de la concentration des substances utilisées. Il est conseillé de faire un essai préalable en cas de première manipulation.

Résultats


Arc de précipitation
    • Entre l’antigène BSA et le puits central contenant le sérum de lapin traité (P), on distingue un arc de précipitation.
    • Cet arc n’existe pas dans la boîte dont le puits central contient le sérum N.

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