Trois conférences et démonstrations techniques à l’Ecole Normale Supérieure de Lyon
La cytométrie en flux, la PCR quantitative ou Q-PCR, la bioinformatique et l’annotation des génomes.
La cytométrie en flux (Fluorescence Activated Cell Sorting)
Présentation par Chloé Journo, Agrégée préparatrice à l’ENS
L’approche microscopique des caractéristiques cellulaires si on vise à les identifier cellule par cellule est longue, très lourde et délicate (possibilité d’erreur liée à l’observation). Le cytomètre de flux (FACS) est un outil d’analyse automatique rapide, puissant, sûr et permettant d’identifier cellule par cellule telle ou telle caractéristique. Il permet d’analyser des paramètres sur la cellule vivante et des perspectives immenses s’ouvrent lorsque les cellules sont marquées spécifiquement.
Le cytomètre comporte une chambre de lecture éclairée par un rayon laser devant lequel les cellules passent une à une.
Deux paramètres sont mesurables directement, sans marquage cellulaire :
la taille de la cellule : plus la cellule est grosse, plus la diffusion du rayon, dans son axe, est grande (diffusion axiale ou FSC).
sa granularité : plus la cellule est granuleuse, plus la diffraction du rayon observée latéralement est grande (diffusion latérale ou SSC).
L’afficheur numérique des résultats produit un graphique avec SSC en ordonnées et FSC en abscisses. L’analyse d’un échantillon porte en général sur un nombre de cellules allant de 10000 à 100000. Chaque point sur le diagramme correspond aux caractéristiques d’une seule cellule.
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Diagramme ci-contre obtenu avec un échantillon de sang
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Le marquage spécifique par anticorps fluorescent permet de mesurer des paramètres indirects.
Le cytomètre prélève chaque échantillon dans des puits d’une cuve à échantillons, sur lequel un certain nombre de paramètres sont analysés puis passe à un second échantillon cellulaire ayant subi une préparation différente ou issu d’une population cellulaire particulière : il s’agit la du protocole expérimental décidé par le chercheur et non plus de la technique de cytométrie.
Ainsi, on peut fixer sur les cellules un marqueur particulier repéré par sa fluorescence : des diagrammes de fluorescence par l’utilisation de Fluoresceine Iso Thio Cyanate (FITC) sont obtenus avec le nombre de cellules ayant telle ou telle intensité de fluorescence (le diagramme peut être unimodal lorsque la population est homogène mais aussi multimodal, signe de l’existence de différents types cellulaires. L’analyse multiparamétrique (actuellement on peut détecter jusqu’à 19 paramètres différents et ainsi distinguer des populations de cellules les unes des autres) est donc possible en faisant varier la longueur d’onde d’excitation, grâce aux filtres séparant les longueurs d’ondes issues de l’échantillon soumis au rayon laser.
Les cellules repérées selon leurs caractéristiques, peuvent aussi être triées dans un champ électrique après avoir été chargées positivement ou négativement ou non chargées. Ainsi différentes populations de cellules peuvent être séparées.
A voir : le site de Jussieu sur le principe du marquage par FITC : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Microscopie/fluo/fluoverte.htm
Voir le logiciel WINMDI, logiciel d’analyse et de présentation de données cytométriques : http://www.inrp.fr/Acces/biogeo/immuno/winmdi.htm
Photographies :
Le cytomètre |
Ecrans en cours d’analyse |
La PCR quantitative ou Q-PCR (Polymerase Chain Reaction)
Présentation par Jean-Marc Vanacker, directeur de recherche au CNRS
La Q-PCR est une méthode particulière de PCR permettant de mesurer la quantité initiale d’ARN, et donc ici le niveau d’expression d’un gène (après rétrotranscription des ARN messagers). La PCR est une technique dite d’amplification de très petites quantités d’ADN de séquence connue c’est-à-dire de multiplication d’un fragment en plusieurs millions d’exemplaires. On fournit, pour permettre la synthèse, outre l’ADN à copier, des oligonucléotides (ou amorces) : les primers et des nucléotides libres fournissant la matière pour les copies. Les amorces sont des oligonucléotides, c’est-à-dire des ADN monobrins correspondant chacun au début de la séquence de l’ADN à copier (deux amorces différentes : l’une pour le début sens 3’ et l’autre pour le sens 5’).
Les échantillons sont préparés dans les puits de plaque à 96 puits. Les puits sont ensuite scellés et la machine ne fait que chauffer ou refroidir puis doser la quantité de signal correspondant à de l’ADN double brin amplifié. Durant 1 cycle, la machine porte l’échantillon à 95°C ce qui dénature les matrices d’ADN (sépare les deux brins) puis à 60°C pour permettre à la fois l’hybridation des amorces et l’élongation grâce à l’action de la TAQ polymérase (enzyme provenant de la bactérie Thermophilus Aquaticus) qui résiste à ces hautes températures. Ce cycle est répété un grand nombre de fois avec à chaque fois de nouvelles synthèses de l’ADN que l’on veut copier (la synthèse est exponentielle car les copies sont elles mêmes copiées à chaque cycle). On réalise en général 40 cycles pour l’amplification.
Voir sur le site de l’ENS une schématisation des étapes de la PCR :
http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm
Tous les échantillons (puits) sont amplifiés en parallèle par l’appareil. Les courbes d’amplifications sont affichées à l’écran ce qui permet de suivre l’état de l’amplification. Les échantillons sont constitués selon le protocole de l’expérience en cours. On utilise dans les puits des témoins dont des gènes dits de ménage, dont le niveau d’expression n’est pas dépendant des conditions de stimulation des cellules.
Le point d’inflexion de la courbe d’amplification (le décollage de l’amplification exponentielle) est pris en compte pour mesurer/estimer la quantité initiale de matrice. On peut faire de la quantification absolue si on fait une gamme avec une matrice d’ADNc de quantité connue ; ou alors de la quantification relative en 1-divisant par la quantité mesurée pour le gène de ménage, 2- en comparant les échantillons testés (par exemple, cellules exposées aux hormones) aux échantillons non stimulés (dans cet exemple, les cellules non stimulées).
Photographies :
L’appareil |
L’amplification de N échantillons |
La bioinformatique et l’annotation des génomes
Présentation par Domitille Chalopin, doctorante en biologie moléculaire
Il y a plusieurs centaines de génomes complets disponibles dans de grandes bases de données sur internet, principalement « NCBI » et « Ensembl ». Les bases de données comprennent également des EST (Expressed Sequence Tags) : il s’agit de l’inventaire des ARNm exprimés par un organisme, un tissu, des cellules à un stade de développement, ou lors de pathologies. Les EST représentent le transcriptome.
Exemples de banques de séquences généralistes :
nucléotidiques : EMBL (Europe), GenBank (USA), DDBJ (Japon) (nb : elles échangent leurs données quotidiennement, et ont donc un contenu identique)
protéiques : UniProtKB/Swiss-Prot (annotation et revue manuelles) et UniProtKB/TrEMBL (annotation automatique)
Un génome est beaucoup plus qu’un simple ensemble de gènes : on y trouve des unités de transcription (des gènes), codant pour des protéines, ou encore codant pour des ARN (ARN ribosomaux, transferts, nucléolaires, etc.), mais aussi de l’ADN non-codant tel que des éléments de régulations (promoteurs, enhancers), des éléments nécessaires à la réplication (origines, télomères, centromères, etc.) et des séquences non fonctionnelles (séquences répétées, pseudogènes). Les séquences non-codantes représentent 95 à 98% du génome humain. Elles comportent une majorité d’éléments transposables (50% du génome), des séquences d’ADN capables de se déplacer et de se multiplier de manière indépendante dans le génome.
Annoter un génome revient à identifier dans la séquence de nucléotides les différentes parties structurales ou fonctionnelles (par exemple les exons et les introns).
Des requêtes sur les bases de données permettent de récupérer des séquences sur lesquelles travailler. Il est possible, par exemple, de mettre en évidence les zones d’épissage, i.e. introns/exons, à partir des séquences génomique et ADNc d’un gène (notamment avec le logiciel SeaView). On peut également rechercher le même gène dans plusieurs espèces différentes (gènes nommés orthologues) pour construire des arbres phylogénétiques.
L’alignement des séquences peut aussi se faire avec le logiciel Seaview, ou encore avec Geneious™ Basic (version gratuite téléchargeable) avec lequel l’ensemble de la gestion de séquence est possible (alignement, arbre, prédiction de structure, ...).
Sur un arbre phylogénétique, le bootstrap (probabilité entre 0 et 1) donne une idée de la robustesse d’un nœud ou d’une branche. Le nœud est considéré comme robuste pour un bootstrap supérieur à 0,7.
