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Cultures de cellules embryonnaires

Courrier à l’auteur
TP proposé par Mme M.J. Pellerin, lycée La Martinière Duchère, Lyon (69)
  • Matériel nécessaire
    • oeufs de caille en incubation depuis 3 jours à 37 degrés
    • loupe binoculaire, étuve réglée à 37
      degrés
    • javel, coton, alcool, feutre marqueur indélébile
    • poubelle en verre, centrifugeuse électrique
    • instruments et milieux stériles :
      • 5 ou 6 feuilles de
        papier pliées en deux dans champ stérile (dans papier alu)
      • ciseaux fins, pinces à bout rond, aiguilles affutées
        (=microscalpels)
      • récipient en verre,petit récipient en
        verre, 2 pipettes Pasteur boutonnées et cotonnées et poire
      • une boite de Pétri remplie de paraffine noire (paraffine
        additionnée de noir animal)
      • épingles très fines (à insectes n. 0)
      • tubes à centrifuger
      • un flacon de culture cellulaire (flacon plat)
      • un flacon de milieu (milieu de Tyrode)
      • milieu de culture enrichi en sérum de veau (10 pour cent), tube à hémolyse
      • Trypsine EDTA + antibiotiques (1 ml en tube à
        hémolyse).
  • Protocole de mise en culture de cellules d’embryon de caille
  • nettoyer la paillasse à la javel en enlevant tout objet
    personnel puis se laver soigneusement les mains et avant-bras.
  • les instruments stériles ne sont jamais posées sur la paillasse mais glissés entre les feuilles de papier stériles, le papier alu étant replié par dessus
  • passer l’oeuf à l’alcool à l’aide du coton ; découper une fenêtre au sommet de la coquille (petit bout) avec les ciseaux.
  • verser le contenu de l’oeuf dans le récipient stérile contenant le milieu de Tyrode.
  • repérer l’embryon et découper l’aire
    extra-embryonnaire à l’aide des ciseaux
  • transférer l’embryon dans le petit récipient stérile rempli de milieu de Tyrode à l’aide de la pince ; éliminer le jaune résiduel en agitant
  • transférer l’embryon dans la boite de Pétri à fond noir remplie de milieu de Tyrode
  • épingler l’aire extra-embryonnaire en inclinant les épingles pour ne pas gêner l’observation
  • observer l’embryon à la loupe binoculaire
  • dégager l’embryon de ses enveloppes à l’aide des microscalpels
  • prélever doucement l’embryon à l’aide d’une pipette Pasteur et l’installer dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA (digestion ménagée des protéines embryonnaires) additionnée
    de 1% d’antibiotiques.
  • placer le tube contenant l’embryon à l’étuve à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes selon sa
    taille.
  • à l’aide d’une pipette Pasteur aspirer et rejeter plusieurs fois
    l’embryon qui se désagrège alors
  • ajouter immédiatement 1 ml de milieu de culture contenant du
    sérum à 10% inhibant l’action de la trypsine ; bien mélanger par aspirations et rejets successifs puis ajouter à nouveau 2 ml de milieu enrichi en sérum afin d’inhiber complètement les protéases. Bien mélanger.
  • centrifuger le tube 10 secondes à 1200 tours
    minute, jeter le surnageant ; ajouter 1 ml de milieu de culture pour faire une suspension cellulaire
  • introduire stérilement dans le flacon de culture
    cellulaire 1 ml ou un peu plus de suspension cellulaire
  • placer ce flacon bien horizontalement dans l’étuve à 37 degrés
  • Suivi des cultures
  • le lendemain, ajouter du milieu afin d’avoir une épaisseur de liquide d’environ 1 mm.
  • tous les 2 ou 3 jours, éliminer stérilement le tiers ou plus de milieu de culture et le remplacer par du milieu neuf.
  • Résultats et conditions d’obtention de résultats
    • nécessité de posséder un microscope
      inversé à contraste de phase
      pour l’observation des cellules vivantes
    • on obtient le lendemain des fibroblastes et un peu plus tard des
      neurones qui s’organisent en réseau
  • TP coûteux (notamment flacons de cultures et microscope !) et
    nécessitant le respect de la stérilité, sinon on cultive des bactéries !
    Voir fournisseurs de matériel de culture cellulaire
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